はじめに
脳血管疾患としての頭蓋内動脈瘤（IA）は、年間約1-2％の発生率を有し、血管破裂による死亡率が高い脳内動脈のバルーニングを特徴とする（Rinkel、2008;Brown and Broderick、2014）。 進行中の研究は、血行力学的ストレス、血栓形成、細胞外マトリックス分解、炎症応答およびSMC表現型変調および結果的にアポトーシスを含む構造変化とし 2012年、フロセン、2014年）。 IAのための現在の処置は主に特別な特徴に基づいて外科介在およびendovascular巻くことのための切抜きを含みます。 実験的動脈瘤研究は、主に、自己内皮細胞種子ステントなどの内皮細胞に焦点を当てている（Ｚｈｕ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ８）およびエリスロポエチン誘導内皮前駆細胞刺激による動脈瘤頚部内皮化の増強（Ｌｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). さらに、内皮損傷は、Ｓｍｃの内膜への反応および移動から生じ得る（ＥｔｍｉｎａｎおよびＲｉｎｋｅｌ、２ ０ １ ６）。 証拠はまた、Ｓｍｃｓが結紮モデルにおける新内膜形成に関与する可能性があることを示している（Ｙｕａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2017). さらに，内皮細胞の機能不全およびｓｍｃｓのアポトーシスまたは表現型変調は動脈りゅうの進行を促進する可能性がある。
SMCsの表現型変調または脱分化は、遺伝的欠陥によって引き起こされるか、または多くの血管疾患に関与するストレスによって刺激され得る（Frosen、2014;Liu et al., 2015). ＳＭＣは、内側層の合成表現型を変化させ、それによって血管壁を弱め、止血を妨害し、そして最終的に血管構造を崩壊させる。 マイクロアレイを用いた以前の研究（Yu et al. ら、２ ０ １ ４）、ｍＲＮＡ配列決定解析（Ｋｌｅｉｎｌｏｏｇ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ６）、およびｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、2016）は、Ｓｍｃの増殖、遊走、およびアポトーシスに関与する報告された遺伝子、ｍＲＮＡおよび関連タンパク質の群を関与させている。 これまでの研究では、炎症によるＳｍｃの傷害または死亡が動脈瘤の発生および発生をもたらすことが実証されている。 さらに、Ｓｍｃは、脳血管および動脈瘤の壁の主要な構成要素である（Ｋｏｎｄｏ ｅ ｔ ａ ｌ． 1998年、オーウェンズ、2007年）。 Ｉａｓｍｃは動脈瘤壁から単離されたので、これらの細胞は、動脈瘤の形成、進行および破裂におけるＳｍｃの表現型および機能を理解するための細胞モデルと ら，２ ０ ０ ６；Ｂｙｇｇｌｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011).
本研究の目的は、IAの病因におけるSMC表現型変調の役割を探求することでした。 我々は、iaの病理学における特定のタンパク質機能を探索するためにプロテオミクス解析を使用しました。 臨床サンプルの結果をさらに説明し、ｉａ進行における動脈瘤Ｓｍｃの役割を調査するために、ＩＡＳＭＣを単離した。
材料と方法
倫理声明
この研究は、制度審査委員会（IRB）と中国復旦大学華山病院の倫理委員会によって承認されました。 各参加者は、この研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
組織収集とラベルフリー Proteomic
顕微手術クリッピングを受けたIA患者十人が登録され、サンプルが収集されました。 対照群には、STA手術を受けた患者が含まれ、続いて避けられないクリッピングが含まれた。 10サンプルのうち、5はラベルフリーのプロテオミクスに使用され、2は免疫染色に使用され、3はウェスタンブロッティングに使用された。 これらの１ ０個の試料を、さらなる実験のために−８ ０℃で直ちに凍結した。 これらの10個の試料に加えて、別の4個の試料がIASMC単離のために使用され、そのうち3個の試料が成功した。 これらの１ ０個の試料は全て、さらなる実験のために−８ ０℃で直ちに凍結した。 ラベルなしのプロテオミクスは中国科学院の上海の枝によって依託されました。
IASMC単離および培養
頭蓋内動脈瘤組織は、マイクロサージャリー中に3IA患者の脳組織から得られた。 修正された単離プロトコルは、以前に記載された研究に基づいていた（Bygglin et al. ら、２ ０ １ １；Ｈｕａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2017). クリッピング後、試料を直ちに５％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中に収集した。 組織セグメントは、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で三回洗浄した。 周囲の結合組織を分離し，内皮細胞層を穏やかに掻爬した。 次いで、組織を皿上に均等に配置された1mm×1mmの断片に解剖し、5％CO2および95％空気の加湿雰囲気中で37℃で、20％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEMを含む培地中でインキュベートした。 １〜２週間後、Ｉ Ａ外植片から増殖させた細胞は半流動に達し、トリプシン化後に平滑筋細胞培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で継代培養した。 対照ヒト脳血管Ｓｍｃを、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から入手し、平滑筋細胞培地中で培養した。 我々は、SMCsを識別するためにマーカー抗ミオシン-11とSMAを使用しました。
ヒト組織サンプルの免疫染色
サンプルは4％パラホルムアルデヒドに固定され、パラフィンに埋め込まれた。 ０クエン酸緩衝液中でのマイクロ波による抗原検索の後、切片を、抗ミオシン−１ １（１：５ ０希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、抗ＭＬＣＫ（１：２ ０ ０希釈）とインキュベートした。; Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、および抗ＳＭＡ（１：１ ０ ０希釈；Ａｂｃａｍ）、続いて免疫蛍光二次抗体を投与した。 次いで、脳切片をＤＡＰＩで染色し、装着した。 画像は、顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｓｏｌｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて異なる倍率で撮影した。ヒト脳血管平滑筋細胞（Ｈｂｖｓｍｃｓ、Zhongqiao Xinzhou Company、Shanghai、China）を、６ウェルプレート上に播種した。
ＭＬＣＫ ｓｉＲＮＡ干渉
ヒト脳血管平滑筋細胞（Ｈｂｖｓｍｃｓ、Zhongqiao Xinzhou Company、Shanghai、China）を、６ウェルプレート上に 次いで、１ ０ ０ｎｍｏｌ／Ｌ ｓｉＲＮＡを、２ ５ ０μ ｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）で希釈し、５分間インキュベートした。 次に、１ ０μ ｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２ ０ ０ ０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を、２ ５ ０μ ｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈し、５分間インキュベートした。 上記の試料を混合し、最終的な５ ０ ０μ ｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液を生成し、２ ０分間インキュベートした。 この培地を２ｍｌのＳＭＣＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）に加え、細胞と６時間インキュベートした。 以下のsiRNA配列を使用した：si-mlck: 5′-3’CCTGCTTTTCATTTTGCCCC,TCACAAGGCTGAAAGTCCCC.
細胞生存率アッセイ
平滑筋細胞は、96ウェルプレートで三重にめっきされた4×103ウェルあたりの細胞。 24時間後、細胞を以下を含む異なる用量でTNF-αで処理した。0, 0.5, 5, 10, 20, ｃｃｋ−８アッセイキットを製造業者の説明書に従って調製し、次いで１ ０ ０μ ｌを各ウェルに添加し、３ ７℃で２時間インキュベートした。RNA抽出およびリアルタイムPCR
TRIzol reagent(Invitrogen)を使用して、製造元の説明書に従って全RNAを細胞から単離した。 ＲＮＡの完全性を、ｎａｎｏｄｒｏｐ１ ０ ０ ０分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＴ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を用いて定量した。 逆転写反応およびリアルタイムＰＣＲを、ａｂｓｃｒｉｐｔ Ｉ Ｉ ｃ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ，Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ）およびＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘｔａｑ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｄａｌａｉｎ，Ｃｈｉｎａ）についての製造業者の説明書に従って、リアルタイムＰＣＲシステム（７ ９ ０ ０Ｈ Ｔ，ＡＢＩ）によ No non-specific amplification was observed based on the dissociation curve. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal control. The data were analyzed using the comparison Ct (2-ΔΔCt) method and expressed as a fold change relative to the respective control. The following sequences were used for qPCR primers: ACTA2: 5′-3′ TTGAGAAGAGTTACGAGTTG, AGGACATTGTTAGCATAGAG; MYL9: 5′-3′ CGGGCCACATCCAATGTCTT, CCATGTTTGAGGATGCGGGT; MLCK: 5′-3′ GGGGACTTTCAGCCTTGTGA, CTGCTTCGCAAAACTTCCTTCT; and CNN1 5′-3′ GGCCCAGAAGTATGACCACC, CCGTCCATGAAGTTGTTGCC.
ウェスタンブロッティング分析
レーンあたりの同量のタンパク質（30μ g）を12％SDS-PAGEゲル上で電気泳動に供した。 タンパク質をポリビニリデン二フッ化膜（ＰＶＤＦ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）上に電気伝達した。 膜を、室温で１時間、トリス緩衝生理食塩水中の５％非脂肪乾燥乳／０.１％Ｔｗｅｅｎ−２ ０で遮断した。 その後、膜を、ウサギ抗ＭＬＣＫ（１：５ ０ ０ ０希釈、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＳＭＡ（１：２ ０ ０希釈、Ａｂｃａｍ）、およびウサギ抗切断カスパーゼ−３（１：５ ０ ０ ０希釈、Ａｂｃａｍ）を含む、異なる一次抗体とインキュベートした。:１ ０ ０ ０希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。 続いて、膜を二次抗体で室温で２時間処理した。 免疫ブロットを、増強されたＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して調査した。 化学発光レベルは、イメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して記録した。 結果はβ-アクチンに対して正規化された。
カルシウムFluo-4AMアッセイと収縮研究
平滑筋細胞は、以前の研究に記載されているように、室温で40分間細胞外溶液中のカルシウム感受性フルオロフォアFluo-4AMでプリロードされました(Granata et al., 2017). その後、細胞を室温で３ ０分間洗浄した。 細胞内カルシウムフラックスを時系列として監視し、取得率は、ピロカルピンの添加前後にライカ共焦点顕微鏡を用いて1フレームごとに0.1ms1分 細胞内カルシウム放出を検出するために，Ｓｍｃｓをカルセインとインキュベートした。 20mMカルセインの濃度は、刺激のために使用されました。 カルシウム流束は、ＴＮＦ−α刺激前後のＨｂｖｓｍｃｓ（Zhongqiao Xinzhou Company,Shanghai,China）、ｓｉ−ＭＬＣＫＳＭＣｓ、およびＩａｓｍｃｓで検出された。 視野から５つの細胞を無作為に選択し、ｉｍａｇｅｊ ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して蛍光トレースを分析した。
統計分析
すべてのデータは平均±SEとして表されました。 遺伝子発現にはＳｔｕｄｅｎｔ–Ｎｅｗｍａｎ–Ｋｅｕｌｓ多重比較後テストを用いたＡ ＮＯＶＡを用いた。 二つのグループ間の比較は、Studentのt検定によって行われました。 A p<0.05は大幅に異なると考えられていました。 統計解析はPrism GraphPad6を用いて行った。 各ｉｎｖｉｔｒｏ実験群を３回繰り返し，実験を３回別々に行った。 これらの結果は、統計的に平均化されたデータからのものです。
結果
サンプル収集とラベルフリーのプロテオーム分析
頭蓋内動脈瘤（n=5）とSTA（n=5）グループは、性別、年齢、または危険因子に有意差がない より多くの情報は補足の表1で示されている。 試料収集の位置を、Ｈ ＥおよびＭａｓｓｏｎ染色によって示した（図１Ａ）。 動脈りゅう壁はＳＴＡ壁に比べて筋肉とコラーゲンが少なかった。 15426個のペプチドから同定された1908個のタンパク質のうち、IAとSTAの間に有意に差動的に発現する180個のタンパク質が同定され、そのうち88個がアップレギュレートされ、92個がダウンレギュレートされた(図1B)。 GOオントロジー解析では、タンパク質を”分子機能”、”細胞成分”、”生物学的プロセス”のサブカテゴリに分類しました。 さらなるタンパク質発現データは、生物学的プロセスの変化を説明するために、KEGG Mapper経路から得られた（図1C）。 ＭＬＣＫはミオシン軽鎖キナーゼとして知られるミオシンＩ Ｉの調節軽鎖をコードしており，Ｉａｓでダウンレギュレートされていた。 血管平滑筋収縮経路では、平滑筋収縮のメカニズムにMLCKが関与していた（図1D）。
図1. ラベルなしのproteomicsからの基本的な情報および組織サンプルの証明。 （Ａ）Ｈ ＥおよびＭａｓｓｏｎ染色を伴うＩ ＡおよびＳＴＡの図は、標識なしプロテオミクスのための標本の位置を示す。 （Ｂ）Ｉ ａとＳＴＡとの間のタンパク質レベルの有意差。 (C)IAとSTAの間でオントロジー解析を行う。 （Ｄ）平滑筋細胞（Ｓｍｃ）のＫＥＧＧ経路マッピング。 （Ｅ）ＳＴＡおよびＩＡにおけるＳＭＡ／ミオシン−１ １およびＳＭＡ／ＭＬＣＫの二重染色を、より近い視野のために２倍の倍率で実施した。 （Ｆ）組織試料中のＭＬＣＫおよびＳＭＡのウェスタンブロットおよび定量研究。 S1–S3は三つの異なるSTAサンプルからのタンパク質を表し、A1-A3はIAサンプルを表します。 STA、表在側頭動脈;IA、頭蓋内動脈瘤。
MLCKは、組織サンプルと一次Iasmcの両方でダウンレギュレートされています
STAおよびIAからの組織サンプルは、SMAおよびMLCKについて二重染色されていました。 ＭＬＣＫはＩ ａ群で高い発現を示し，ＳＭＡはＩ Ａ群に比べてＳＴＡ群で弱い発現を示した。 ミオシン-11は成熟したSMCsのマーカーであり、SMAとの共染色は収縮性SMCsの減少を示した。 倍率も低いＳＭＡ発現を示し，これはＩ ａ組織におけるＳｍｃｓの損失を示した。 SMC密度はiaサンプルの有意な減少を示し、動脈瘤壁に変性が起こったことを示した（図1E）。 ＩＡ試料はＳＴＡよりもＭＬＣＫの有意なダウンレギュレーションを示し，プロテオミクスの所見と一致した。 ＳＭＡもダウンレギュレートされ、これは、機能的に成熟したＳｍｃが動脈瘤壁で失われたことを示唆した（図１Ｆ）。 Ｉ Ａ組織におけるＭＬＣＫの下方制御がＳｍｃにおいて同様の効果を有するかどうかを調べるために、本発明者らは、ｉ ａ壁（Ｉａｓｍｃ）から一次Ｓｍｃをさらに単離した。 Ｉａｓｍｃは形態学的に調節され，成熟ＳＭＣマーカーの喪失を伴うクモ様細胞として出現した。 これらの形態学的変化は，応力が突然増加すると延性が減少することを示した。 細胞生存率はまた、培養プロセスを通じて弱まった。 IASMCsは不規則な形で現れ、HBVSMCSと比較してSMA、MLCKおよびミオシン-11に対して弱い陽性を示した。 免疫染色の結果、IASMCsは未成熟状態にあることが示された（図2）。
ミオシン軽鎖キナーゼ一次SMCs。 明視野画像は，Ｈｂｖｓｍｃよりも不規則な形態を有するＩａｓｍｃを示した。 SMA/ミオシン-11およびSMA/MLCKの二重染色は、IASMCsがHBVSMCsと比較して少ないか弱い陽性であったことを示した。 データは、平均±ＳＤ、≦ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝”ｅ７ ３ｂ０ａ６ｂｆ１”＞＜／ｄｉｖ＞０． HBVSMCの人間の頭脳の管の平滑筋の細胞;IASMCのintracranial動脈瘤の平滑筋の細胞。
一次IASMCsにおけるMLCKダウンレギュレーションとSMC機能への影響
SMCsの機能を調査するために、我々はIASMCsの遺伝的欠陥を模倣するためにHBVSMCsにおけるmlck Mlckのレベルは50％の干渉を示し、Iasmcと比較して有意差はなかった（図3A）。 ウェスタンブロットの結果は、成熟したSMCマーカー MLCKとSMAの発現がHBVSMCsと比較してIASMCsとsi-mlckSMCsの両方で減少したことを示した。 我々は、アポトーシスを検出するために切断されたカスパーゼ-3を使用しました。 その結果、成熟したSMCマーカーが失われると、Smcはおそらくアポトーシスに進行することが示された（図3B）。
図3. Ｓｉ-ｍｌｃｋｈｂｖｓｍｃｓとＩａｓｍｃｓはいずれも弱い増殖と収縮を示した。 （Ａ、Ｂ）Ｈｂｖｓｍｃｓ、ｓｉ−ＭＬＣＫＨＢＶＳＭＣｓおよび一次ＩａｓｍｃｓにおけるＭＬＣＫ発現は、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで検出された。 （Ｃ）フルオ−４ａ Ｍ負荷によって測定されたＣａ２＋フラックスおよびｈｂｖｓｍｃｓ、ｓｉ−ＭＬＣＫＨＢＶＳＭＣｓ、およびＩａｓｍｃｓの強度を、ピロカルピンによる刺激時（４秒）および刺激後４ ５秒で、基礎レベ （Ｄ）Ｈｂｖｓｍｃｓ、ｓｉ−ＭＬＣＫＨＢＶＳＭＣｓ、およびＩａｓｍｃｓの細胞表面積における蛍光変化として測定される収縮性の定量化。 相対ｍＲＮＡレベルをｇａｐｄｈに対して正規化した。 データは、平均±SD、∗p<0.05、∗ ∗P<0.01として提示されます。 ＨＢＶＳＭＣ，ヒト脳血管平滑筋細胞；ＩＡＳＭＣ，頭蓋内動脈瘤平滑筋細胞；ｓｉ-ｍｌｃｋｓｍｃ，干渉ｍｌｃｋを有するＨｂｖｓｍｃｓ。
我々は、さらにSMC収縮中のMLCKの役割を調査するために、これら三つのグループにおける細胞収縮性を検出しました。 ピロカルピンは、コリン作動性受容体を活性化することができるコリン作動性薬剤である。 SMCsは刺激と契約に応答することができます。 Ｓｍｃｓをか焼とインキュベートすると，細胞内カルシウム放出が検出された。 カルシウムの流入は”収縮”と同じではないが、アゴニストに応答する環状カルシウム波は細胞収縮性を反映する可能性がある。 低ＭＬＣＫ発現を有するｓｍｃは，コリン作動薬ピロカルピンによる刺激に応答して収縮性が低下した。 これら三つの群の局所細胞形態もピロカルピンでシミュレートしたときに異なっていた。 HBVSMCsは紡錘状を示し、MLCKの発現が低い細胞はより星状のパターンを示した（図3C）。 Ｈｂｖｓｍｃｓの細胞内カルシウム応答はｓ ｉ-ｍｌｃｋｓｍｃｓおよびＩａｓｍｃｓの細胞内カルシウム応答とは異なっていた。 HBVSMCsは周期的なカルシウム波を生成したが、si-mlckSMCs、特にIASMCsは伝播するカルシウム波を生成せず、突然基底レベルに戻った（図3D）。
MLCKの遺伝的損失は、Smcの炎症応答に影響を与える
IA環境を模倣するために、我々は、Smcの増殖と収縮性を探索するためにTNF-αを投与した。 ４つの成熟ＳＭＣ遺伝子、ｍｌｃｋ、ａｃｔａ２、ｍｙｌ９、およびｃｎｎ１のｍＲＮＡレベルを、異なる用量のＴＮＦ−αで処理した後に検出した（図４Ａ）。 成熟ＳＭＣマーカー発現は，高用量のＴＮＦ-αによる刺激によって減少することを見出した。 ＡＣＴＡ２、ＭＹＬ９、ＣＮＮ１、およびＭＬＣＫなどの成熟ＳＭＣマーカーの発現は、培養Ｓｍｃ中の他のＴＮＦ−α濃度での処理後のものと比較して、４ ０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αでの処理後に大きく減少した。 したがって、本発明者らは、Ｈｂｖｓｍｃ、ｓｉ−ＭＬＣＫＳＭＣ、およびＩａｓｍｃを治療するために、４ ０ｎｇ／ｍｌの濃度を使用した。 興味深いことに、TNF-αで刺激したHBVSMCsは、IASMCsおよびsi-mlckSMCsよりも低い細胞生存率を示した。 したがって、細胞生存率に対する遺伝子レベルでのmlck欠乏症の影響は、炎症に対するそれとは異なる可能性がある（図4B）。 我々はさらに細胞の生存率への影響を調査するために細胞収縮性を再検出しました。 全ての細胞はピロカルピン刺激に応答して収縮性が低下し，細胞形態が変化した。 しかし，Ｈｂｖｓｍｃｓは細い紡錘形として現れたが，依然としてピロカルピンに反応した。 Ｉａｓｍｃについては，細胞形態は明らかではなく，刺激に対する応答はほとんどなかった。 Si-mlckSMCsは短い棒状として現れたが、カルシウム刺激に対する応答は弱い（図4C）。 MLCKが減少すると、3つのグループすべてで収縮性が低下し、Iasmcはカルシウム波をほとんど生成できず、遺伝的にMLCKを欠いている細胞は炎症性発作に対してより脆弱であるように見えることが明らかに観察された(図4D)。
図4. 遺伝的にダウンレギュレートされたＭＬＣＫはＴＮＦ-αの刺激により細胞機能に影響を及ぼす。 （Ａ）ｈｂｖｓｍｃを勾配用量のＴＮＦ−αで処理し、成熟ＳＭＣマーカー ＭＬＣＫ、ＡＣＴＡ２、ＭＹＬ９、およびＣＮＮ１のレベルを検出した。 （Ｂ）３種類の細胞全てをｃｃｋ−８により細胞生存率について検出した。 (C)Ca2+fluo-4AMを装填して測定したフラックス。 （Ｄ）Ｈｂｖｓｍｃｓ、ｓｉ−ＭＬＣＫＳＭＣｓ、およびＩａｓｍｃｓの細胞表面積における蛍光変化として測定される収縮性の定量化。 相対ｍＲＮＡレベルを対照に対して正規化した。 データは、平均±SD、∗p<0.05、∗ ∗P<0として提示されます。01,p p<0.001. ＨＢＶＳＭＣ，ヒト脳血管平滑筋細胞；ＩＡＳＭＣ，頭蓋内動脈瘤平滑筋細胞；ｓｉ-ｍｌｃｋｓｍｃ，干渉ｍｌｃｋを有するＨｂｖｓｍｃｓ。
Discussion
この研究では、ラベルフリーのプロテオーム分析を用いてIAサンプルにおけるMLCKダウンレギュレーションの効果を観察しました。 ダウンレギュレートされたＭＬＣＫを有するｓｍｃは表現型変調を受け，ｔｎｆ-αで刺激するとアポトーシスに脆弱であった。 ＭＬＣＫ発現は、Ｉ ａ壁から単離されたＳｍｃでも減少した（図５）。 ダウンレギュレートされたＭＬＣＫを有する正常なＳｍｃｓは収縮機能の障害を示し，炎症に対して脆弱であった。 標識を含まないプロテオーム解析では、ＩＡの病理学において役割を果たすタンパク質が見出され、これは、ＩＴＲＡＱを用いた以前の研究で見出された結果を反映していた（Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). ＤＮＡマイクロアレイを使用して、Ｃｈｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら（２ ０ １ ４）は、ｍｙｈ１ １、ａｃｔａ２、ｍｌｃｋ、およびｍｙ１ ９が、ＶＳＭＣ収縮に関連する遺伝子を差動的に発現することを見出した（Ｃｈｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2014). 私たちの研究は、SMCsに焦点を当て、IA形成にMLCKを失うことの影響を強調しました。
図5. MLCKのダウンレギュレーションは、収縮機能を弱め、炎症に対する脆弱な反応を伴う。 表現型変調とカルシウム依存性リン酸化として表現されるＭＬＣＫの損失はさらに妨げられた。 TNFの環境では、形態学的に変えられた平滑筋はapoptosisにより弱く、敏感です。MLCKがダウンレギュレートされた後、SMCsの収縮が妨げられた。 ＳＭＣは、収縮性の低い遺伝子発現を伴う表現型調節を受け、炎症前の脱分化表現型を示す（Ｏｗｅｎｓ，１ ９ ９ ８；Ｏｗｅｎｓ ｅ ｔ ａ ｌ． 2004年、吉田とオーウェンズ、2005年）。 表現型の変調および最終的な変性は、Ｉ Ａの形成および進行を促進すると考えられている。 ＩＡＳＭＣは、Ｂｙｇｇｌｉｎらによって最初に単離された。 (2011)、および本研究は、IASMCsおよび収縮遺伝子mlckの機能を検出する最初のものでした。 Ｉａｓｍｃは形態学的に調節され，成熟したＳＭＣ特徴の喪失を伴うクモ様細胞として出現した。 ウサギの動脈瘤モデルの研究では、長い細胞質伸長を有する大きく星状細胞が示された（Dai et al., 2006). Ｉａｓｍｃは、もはやしっかりと配置された紡錘形の細胞を示さず、形態は、細胞が互いに解離する疎な無秩序な形態に置き換えられた（ＭｅｒｅｉおよびＧａｌｌｙａｓ、１ ９ ８ ０）。 この形態学的変化は，突然の応力下に置かれたときの延性の低下を示唆している。
平滑筋細胞の収縮および弛緩は、Ca2+が注入される量だけでなく、直接的または間接的に酸化ストレスおよび炎症によっても影響される（Carvalho-de-Souza et al., 2013). 以前の研究では、ミオシン軽鎖ホスファターゼ調節軽鎖がミオシンと関連しており、その収縮はミオシンATPase活性の刺激によって決定されることが示されている（Murthy、2006）。 カルシウムは増加し，カルモジュリンに結合し，カルシウム／カルモジュリン複合体はＭＬＣＫと結合し，ＭＬＣリン酸化をもたらした。 また、形態学的変化を示し、図3、4のダウンレギュレートされたmlckとIASMCsとHBVSMCsの収縮性を検出しました。 Ca2+レベルの増加に伴い、カルシウムはカルモジュリンに結合し、MLCリン酸化につながる可能性がある。 動脈瘤環境では、Ca2+の細胞内濃度は、第二のメッセンジャーとして、減少した。 したがって，カルシウムによって誘導されるりん酸化もダウンレギュレートされた。 Ca2+/カルモジュリン依存性MLCKリン酸化MLCは、平滑筋収縮の開始のために不可欠です。 持続的なＭＬＣりん酸化はＣ ａ非依存性ＭＬＣＫによって誘導された。 したがって、ダウンレギュレートされたMLCKでは、MLCホスファターゼ活性もダウンレギュレートされ得る。 ＭＬＣＫおよびＭＬＣホスファターゼ活性は、細胞の弛緩を調節することができる（Ｍｕｒｔｈｙ、２ ０ ０ ６）。 ＳＭＣ緩和は、Ｒｈｏａ／Ｒｈｏキナーゼ経路の阻害によるＴＧＲ５の活性化に起因し得る。 Ｃａ２＋非依存性ＭＬＣＫを介したＭＬＣリン酸化は、Ｇタンパク質活性化を維持し、ＭＬＣホスファターゼの阻害を調節することができる（Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2013).
mlck遺伝子は、対照動脈と比較してIAにおいて顕著に差動的に発現される。 ＭＬＣＫ発現は炎症刺激によっても減少し，ＳｍｃｓはＴＮＦ-αの高用量でより低い生存率を示した。 頭蓋内炎症中，ＭＬＣＫ発現はＳｍｃｓで減少した。 さらに、ＭＬＣホスファターゼ活性もダウンレギュレートされ得る（Ｍｕｒｔｈｙ、２ ０ ０ ６）。 MLCKがSmcの表現型および機能的変調の原因であるのか、またはその結果であるのかは、ほとんど不明である。 我々の結果は、MLCKがSMC機能不全を促進する可能性があることを示唆したが、これはこの仮説を支持する最初の研究である。 ＴＮＦ−αは成熟ＳＭＣ遺伝子の発現を抑制することができるが、正常なＳｍｃは、特定の炎症条件下で収縮能力を保持することができる（Ａｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2013). MLCKを欠くSmcで炎症が起こったとき、収縮は深く抑制され、したがって、いくつかのIAが個体の生涯を通じて安定性を維持できなかった理由を説明した。
頭蓋内動脈瘤の病理にはアポトーシスも含まれ、動脈瘤壁の内膜および媒体が弱まる。
頭蓋内動脈瘤の病理にはアポトーシスも含まれる。
ＮＦ−αのような炎症因子は、アポトーシスの開始において誘導シグナルを誘発することができる（Ｊａｍｏｕｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ７；ＳｐｒａｇｕｅおよびＫｈａｌｉｌ、２ ０ ０ ９；Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011). ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１は、最も重要な炎症促進因子であり、局所炎症応答を誘導するためにしばしば使用される。 多数の研究は、ｔｎｆ−αが増加し、動脈瘤の発生および発達において重要な役割を果たすことを実証している。 したがって、本発明者らは、動脈瘤の環境を模倣するためにＴＮＦ−αを使用した（Ａｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ３；Ａｏｋｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｓｔａｒｋｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2014). 炎症環境下では、可溶性グアニリル活性によって引き起こされた平滑筋弛緩が阻害された（Rajagopal et al., 2015). Ｓｍｃ機能不全またはアポトーシスは破裂したＩＡにおける破壊的事象と考えられた。 我々の結果は、SMCsにおけるMLCKの損失は、アポトーシスの進行につながると炎症促進環境における傷害を促進することができることを示した。 SMCsの連続的な損失およびコラーゲンおよびマトリックス成分の機能的合成は、動脈瘤の拡大および破裂をもたらした（Frosen、2014）。 我々は、プロテオーム分析によってIAにおけるMLCKの発現の有意な減少があったことがわかった。 MLCK RNAサイレンシングを妨害した後、我々はSMC収縮性が減少し、アポトーシスが増加することがわかった。 さらに、ＳＭＡ発現はダウンレギュレートされた。 したがって，ＭＬＣＫの減少は動脈りゅうの発達を促進する可能性があると推測した。 Ｉ ａおよびＳＴＡ組織における他の多くの減少した蛋白質，例えばフィラミン-Ｃ，デスミンおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼをプロテオーム解析により見出した。 ＭＬＣＫはＩａｓｍｃではあまり発現せず，他の蛋白質は通常Ｓｍｃでは発現しなかったことを示した。 したがって、我々は現在の研究ではMLCKを目標として選択した。さらなる改善が必要ないくつかの制限もありました。
ＩＡ組織からＩＡＳＭＣを単離し、ＳＭＣＭを用いて培養した。 我々は、IA組織の小片を切断することによって直接Ia壁からSMCsを単離し、in vitro培養条件の影響を避けるために三つの通路内の細胞のみを使用しました。 細胞はアポトーシス性で誘導され、数世代にわたって通過することができなかったため、in vitroでの実験が制限されました。 Mlck遺伝子がIASMC機能不全において重要な役割を果たしているかどうか、およびmlck変異が存在するかどうかは、依然としてさらなる調査が必要である。要約すると、本研究は、SMCsにおけるMLCKのダウンレギュレーションが成熟した機能的動脈の組織に影響を与えたことを示す新しい証拠を提供した。
要約すると、本研究は、成熟した機能的動脈の組織に影響を与えた。 ＭＬＣＫの低発現はさらに炎症応答中にアポトーシスを増加させ，Ｓｍｃｓの損失および収縮機能不全をもたらした。 この研究は、SMC機能を検出するために一次IASMCsを使用する最初のものです。 これらの結果は，ＭＬＣＫがＳＭＣ収縮，増殖およびアポトーシスに関与していることをさらに支持する。 また，Ｓｍｃｓの恒常性は頭蓋内動脈の正常機能に重要であることを示した。
著者の貢献
YaSとPLは、実験を設計し、実行し、データを分析し、原稿と図を起草しました。 G-YYとWZはプロジェクトを考案し、実験を設計し、最終原稿を編集しました。 ZLとYuSは研究デザインに参加しました。 JH、SL、YLは標本収集に貢献しました。 ZZとYWは実験を設計し、データを解釈するのに役立ちました。この研究は、上海セーリングプログラム、プロジェクトno.16YF1401200（PL）、中国のNSF、no.81571102（WZ）、中国の国家主要研究開発プログラム（2016YFC1300600）、中国の国家自然科学財団（81771251、G-YY;81771244、ZZ;81471178、g-yy;および81522015、Yw）、k.C.WONG教育財団（G-YY）、および上海市の科学技術委員会（17zr1413600、Zz）。
利益相反に関する声明
著者らは、この研究は、利益相反の可能性と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。
謝辞
著者は、プロテオミクス解析と共同サポートのための神経科学と神経工学センターのスタッフのためのYanye Fengに感謝したいと思います。
補足資料
この記事の補足資料はオンラインで見つけることができます: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2018.00416/full#supplementary-material
Abbreviations
HBVSMC, human brain vascular smooth muscle cell; IA, intracranial aneurysm; IASMCs, intracranial aneurysm smooth muscle cells; MLCK, myosin light chain kinase; SMA, anti-SM-α actin; SMCs, smooth muscle cells; STA, superficial temporal artery.
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