抗体中の遊離スルフヒドリルの定量のためのEllman’S Assay
Ellman’s reagent,5,5′-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid),また、DTNBとして知られている,水溶性化合物は、混合ジスルフィドと高度に発色性の混合ジスルフィドを得るためにわずかにアルカリ性条件で溶液中の遊離スルフヒドリル基と反応する。モル吸光係数（モル吸収率）が14の5-ニトロ-2-チオ安息香酸（Tnb）。15mM-1cm-1で412nm。
これは、小さなペプチドおよびタンパク質中の遊離チオールの定量のためにEncapsula Nanosciencesによって調製された標準プロトコルであり、酸性溶液中で還元され、
Ellmanのアッセイは、Fab’断片およびチオール化抗体をマレイミドを含むリポソームに結合する前に必要である。
Ellmanのアッセイは、Fab’断片およびチオール化抗体
システイン標準を用いたスルフヒドリルの定量
- 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0（反応緩衝液）を調製する。4mg/mLのエルマン試薬、5,5′-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)を反応緩衝液(エルマン試薬溶液)に溶解する。
- 反応緩衝液(エルマン試薬溶液)に4mg/mLのエルマン試薬、5,5′-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)を溶解する。
- 5.268mgの塩酸システイン一水和物（MW=175.6）を反応緩衝液に初期濃度1.5mM（下の表の標準A）で溶解する。 以下の表に基づいて標準Aを連続的に希釈することにより、システイン標準のセットを調製する。
- 各標準にEllmanの試薬の50μ lを加え、よく混合して下さい。
- 室温で15分間インキュベートする。
- 412nmで光の吸光度を測定します。
- 各基準に対して得られた吸光度値とシステイン濃度（検量線）をプロットし、曲線から試料中の遊離スルフヒドリルの濃度を決定する。li>
| 最終濃度（mM） | システイン | 反応バッファー（mL） | 標準 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 最終濃度（mM） | システイン | 反応バッファー（mL） | 標準 | 5.268mg | 20 | a | |||||
| 1.50 | 1.50 | 1.50 | 1.50 | 1.50 | 1.50 | 1.50 | 1.50 | 1.50 | 5 mL of Standard A | 1 | B |
| 1.00 | 4 mL of Standard A | 2 | C | ||||||||
| 0.75 | 3 mL of Standard A | 3 | D | ||||||||
| 0.50 | 2 mL of Standard A | 4 | E | ||||||||
| 0.25 | 1 mL of Standard A | 5 | F | ||||||||
| 0.00 | 0 | 5 | Blank |
Quantification of Sulfhydryls Using Extinction Coefficient Calculation
- Prepare 0.1 M sodium phosphate buffer solution, pH 8.0 (Reaction Buffer).
- Dissolve 4 mg Ellman’s Reagent in 1 mL of Reaction Buffer (Ellman’s Reagent Solution).
- For each sample, prepare two test tubes containing 25 µL of Ellman’s Reagent Solution and 1.250 mL of Reaction Buffer.
- 0.125μ lの未知のサンプルをステップ3で調製した試験管に加えます。
- ステップ3で調製した他の試験管に125μ lの反応緩衝液を加えてブランクを調製する。
- よく混合し、室温で15分間インキュベートする。
- ブランクの分光光度計を412nmでゼロにし、サンプルの光学吸光度を測定します。
注意事項
注意事項: 遊離スルフヒドリルの高濃度（>1mM）は、その高い吸光度値のためにスルフヒドリルの測定された濃度の精度を低下させる可能性がある。 この場合、0.1786mLのアリコートが1mM未満の遊離スルフヒドリルを含むようにサンプル溶液を希釈することが推奨される。
遊離スルフヒドリル濃度の計算方法
ここでは、サンプル中の遊離スルフヒドリルの濃度を計算する方法のステップの例によって簡単２ ５ ０ｍＬの反応緩衝液および２ ５μ ＬのＥｌｌｍａｎ試薬溶液は、１ｃｍの分光光度測定キュベットを用いて（ブランクを差し引いた後に）０． 未知のサンプルのmLあたりのμ molでスルフヒドリル濃度を計算します。 412nmでのこの緩衝系におけるTNBのモル吸光係数は14150M-1cm-1である。 モル吸収率Λは、次のように定義されます。
C_{cuvette}は分光光度キュベット中の溶液の濃度（M）である。 したがって、次のようになります。
M（モル/L）
の濃度を計算するには、
M（モル/L）
サンプルのスルフヒドリル、試金の総容積および自由なスルフヒドリルの総モルは必要です。p>
したがって、アリコート中のスルフヒドリルのモル数：
モル
アッセイ溶液には元のサンプルの0.1786mLしか含まれてい 元のサンプル中の遊離スルフヒドリルの濃度は、以下のように得られる：
M
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