Ellman de Assay Protocol

Ellman de Assay voor de Kwantificering van Gratis Sulfhydryls in Antilichamen

Ellman ‘s reagens, 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic zuur), ook wel bekend als DTNB, is een in water oplosbare verbinding reageert met gratis sulfhydryl groepen in oplossingen op licht alkalische toestand op te leveren is een gemengd disulfide en zeer chromogenic 5-nitro-2-thiobenzoic zuur (TNB) met de molaire extinctie coëfficiënt (molaire absorptivity) van 14.15 mM-1cm-1 bij 412 nm.

Dit is een standaardprotocol dat door Encapsula Nanosciences wordt bereid voor de bepaling van vrije thiolen in kleine peptiden en eiwitten, die gewoonlijk gereduceerd zijn van en stabiel zijn tot oxidatie in zure oplossingen.

Ellman ‘s test is noodzakelijk vóór conjugatie van Fab’ fragmenten en gethioleerde antilichamen tegen liposomen die maleimide bevatten.

kwantificering van Sulfhydrylen met behulp van Cysteïnenormen

1. bereid 0,1 m natriumfosfaatbufferoplossing, pH 8,0 (reactiebuffer).
2. Los 4 mg / mL Ellman-reagens, 5,5′-dithio-bis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) op in de reactiebuffer (Ellman-reagens-oplossing).
3. Los 5,268 mg cysteïnehydrochloride-monohydraat (MW = 175,6) op in reactiebuffer bij een initiële concentratie van 1,5 mM (Standaard A in onderstaande tabel) . Bereid een reeks cysteïnenormen door standaard A op basis van onderstaande tabel seriematig te verdunnen.
4. voeg 50 µL Ellman ‘ s reagens toe aan elke standaard en meng goed.incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. meet de optische absorptie bij 412 nm.
6. zet de absorptiewaarden uit die voor de verschillende standaarden zijn verkregen ten opzichte van de cysteïneconcentraties (kalibratiecurve) en bepaal de concentratie van vrije sulfhydryl in het monster uit de curve.

Quantification of Sulfhydryls Using Extinction Coefficient Calculation

1. Prepare 0.1 M sodium phosphate buffer solution, pH 8.0 (Reaction Buffer).
2. Dissolve 4 mg Ellman’s Reagent in 1 mL of Reaction Buffer (Ellman’s Reagent Solution).
3. For each sample, prepare two test tubes containing 25 µL of Ellman’s Reagent Solution and 1.250 mL of Reaction Buffer.
4. voeg 0,125 µL onbekend monster toe aan een reageerbuis, bereid in Stap 3.
5. Maak een blanco door 125 µL reactiebuffer toe te voegen aan de andere reageerbuis die in Stap 3 is bereid.
6. meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
7. nul de spectrofotometer op de blanco bij 412 nm en meet de optische absorptie van het monster.

Noot: Hoge concentraties (>1 mM) vrije sulfhydryl kunnen de nauwkeurigheid van de gemeten concentratie van sulfhydryl verminderen vanwege de hogere absorptiewaarden. In dit geval wordt aanbevolen de monsteroplossing zodanig te verdunnen dat 0,1786 ml aliquot minder dan 1 mM vrij sulfhydryl bevat.

hoe de concentratie vrije Sulfhydryl te berekenen

Hier is een eenvoudig, stap voor stap voorbeeld van hoe de concentratie vrije sulfhydryl in een monster te berekenen:

een 125 µL aliquot van onbekend monster wordt gemengd met 1.250 mL reactiebuffer en 25 µL van Ellman ‘ s Reagensoplossing gaven een absorptie van 0,750 (na aftrek van de blanco) met behulp van een spectrofotometrische cuvet van 1 cm. Bereken de sulfhydrylconcentratie in µmolen per mL onbekend monster. De molaire extinctiecoëfficiënt van TNB in dit buffersysteem bij 412 nm is 14150 m-1cm-1. Molaire absorptie, Ε, wordt als volgt gedefinieerd:

waar A absorptie is, is d de weglengte (cm) en de concentratie van de oplossing in de spectrofotometrische cuvette (M). Daarom:

M (mol/L)

om de concentratie van sulfhydryl in het monster, het totale volume van de analyse en de totale mol van vrije sulfhydryl zijn nodig.

mL

Daarom, het aantal mol van sulfhydryl in het analysemonster wordt:

mol

Sinds de assay oplossing bevat alleen 0.1786 mL van de originele sample. De concentratie van vrij sulfhydryl in het oorspronkelijke monster wordt als volgt verkregen:

M