Frontiers in Cellular Neuroscience

wprowadzenie

tętniak wewnątrzczaszkowy (IA), jako choroba naczyń mózgowych, ma roczną częstość występowania około 1-2% i charakteryzuje się balonem tętnicy śródmózgowej z wysoką śmiertelnością z powodu pęknięcia naczyń (Rinkel, 2008; Brown and Broderick, 2014). Trwające badania charakteryzują proces powstawania IA jako stres hemodynamiczny, tworzenie skrzepliny, degradacja macierzy pozakomórkowej, reakcje zapalne i zmiany strukturalne, w tym modulację fenotypową SMC, a w konsekwencji apoptozę (Frosen i wsp., 2012; Frosen, 2014). Obecne leczenie IA obejmuje głównie wycinanie do interwencji chirurgicznej i wewnątrznaczyniowe zwijanie w oparciu o jego szczególne cechy. Eksperymentalne badania tętniaka koncentrowały się głównie na komórkach śródbłonka, takich jak autologiczny stent nasienny komórek śródbłonka (Zhu et al., 2008) i wzmocnionej endotelializacji szyi tętniaka przez stymulację komórek progenitorowych śródbłonka indukowaną erytropoetyną (Liu i wsp., 2016). Ponadto uszkodzenie śródbłonka może wynikać z reakcji i migracji SMCs do Tunica intima (Etminan i Rinkel, 2016). Dowody wskazują również, że SMC może być zaangażowany w tworzenie Neo-intima w modelu ligacji (Yuan et al., 2017). Ponadto dysfunkcja komórek śródbłonka i apoptoza lub modulacja fenotypowa SMCs mogą przyspieszyć postęp tętniaków.

modulacja fenotypowa lub dedifferencjacja SMC może być spowodowana defektami genetycznymi lub stymulowana przez stres, który jest zaangażowany w wiele chorób naczyniowych (Frosen, 2014; Liu et al., 2015). SMC zmieniają syntetyczny fenotyp w warstwie przyśrodkowej, osłabiając w ten sposób ścianę naczynia, zaburzając hemostazę i ostatecznie zapadając strukturę naczyniową. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem mikromacierzy (Yu et al., 2014), analiza sekwencjonowania mRNA (Kleinloog et al., 2016) i proteomika (Wang et al., 2016) wiążą się z grupą zgłoszonych genów, mRNA i pokrewnych białek zaangażowanych w proliferację, migrację i apoptozę SMC. Wcześniejsze badania wykazały, że uszkodzenie lub śmierć SMCs przez stan zapalny powoduje występowanie i rozwój tętniaków. Ponadto SMC są głównymi składnikami ścian naczyń mózgowych i tętniaków (Kondo et al., 1998; Owens, 2007). Ponieważ IASMCs zostały wyizolowane ze ścian tętniaka, komórki te zostały uznane za model komórkowy do zrozumienia fenotypu i funkcji SMCs w tworzeniu, postępie i pękaniu tętniaków(dai et al., 2006; Bygglin et al., 2011).

celem niniejszej pracy było zbadanie roli modulacji fenotypowej SMC w patogenezie IA. Wykorzystaliśmy analizę proteomiczną do zbadania specyficznych funkcji białek w patologii IA. IASMCs wyizolowano w celu dalszego wyjaśnienia wyników próbek klinicznych i zbadania roli smcs tętniaka w progresji IA.

materiały i metody

Oświadczenie o etyce

to badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) i Komisję Etyki szpitala Huashan, Uniwersytet Fudan, Chiny. Każdy uczestnik wyraził pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.

pobranie tkanek i proteomika bez etykiety

włączono dziesięciu pacjentów z IA, którzy przeszli wycinanie mikrochirurgiczne i pobrano próbki. Grupa kontrolna obejmowała pacjentów, którzy przeszli operację STA, a następnie nieuniknione wycinanie. Spośród 10 próbek, 5 użyto do proteomiki bez etykiety, 2 użyto do immunostaining, a 3 użyto do Western blotting. Te 10 próbek zamrożono natychmiast w temperaturze -80°C do dalszych eksperymentów. Oprócz tych 10 próbek do izolacji IASMC wykorzystano kolejne 4 próbki, z których 3 odniosły sukces. Te 10 próbek zamrożono natychmiast w temperaturze -80°C do dalszych eksperymentów. Proteomika bez etykiet została zamówiona przez Szanghajski Oddział Chińskiej Akademii Nauk.

izolacja i hodowla IASMC

tkanki tętniaka śródczaszkowego uzyskano z tkanek mózgu 3 pacjentów IA podczas mikrochirurgii. Zmodyfikowany protokół izolacji został oparty na wcześniej opisanym badaniu (Bygglin et al., 2011; Huang et al., 2017). Po obcięciu próbki natychmiast pobrano do DMEM uzupełnionego 5% penicyliną / streptomycyną. Segmenty tkanek przemyto trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) uzupełnionym 1% penicyliną / streptomycyną. Otaczająca tkanka łączna została oddzielona, a warstwa komórek śródbłonka została delikatnie zarysowana. Następnie tkanki rozcięto na fragmenty o wymiarach 1 mm × 1 mm, które równomiernie ułożono na naczyniu i inkubowano w nawilżonej atmosferze 5% CO2 I 95% powietrza w temperaturze 37°C w pożywce zawierającej DMEM uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną. Po 1-2 tygodniach komórki wyhodowane z eksplantów IA osiągnęły Półkrwi i zostały subkulturowane w podłożu komórek mięśni gładkich (Lonza, Bazylea, Szwajcaria) po trypsynizacji. Kontroluj ludzki mózg naczyniowe SMCs uzyskano z laboratoriów badawczych ScienCell (Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone) i hodowano w podłożu komórek mięśni gładkich. Użyliśmy markerów anty-myosin-11 i SMA do identyfikacji SMC.

odporność próbek tkanek ludzkich

próbki utrwalono w 4% paraformaldehydu i osadzono w parafinie. Po pobraniu antygenu przez mikrofal w buforze cytrynianowym pH 6,0, sekcje inkubowano z anty-miozyną-11 (rozcieńczenie 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Stany Zjednoczone), anty-MLCK (rozcieńczenie 1:200; Abcam, Cambridge, MA, Stany Zjednoczone) i anty-SMA (rozcieńczenie 1: 100; Abcam), a następnie immunofluorescencyjne przeciwciało wtórne. Sekcje mózgu zostały następnie zabarwione DAPI i zamontowane. Zdjęcia wykonywano przy różnych powiększeniach mikroskopem (Leica, Solms, Niemcy).

interferencja siRNA MLCK

komórki mięśni gładkich naczyń mózgu człowieka (Hbvsmcs, Zhongqiao Xinzhou Company, Szanghaj, Chiny) zostały zaszczepione na sześciostopniowych płytkach. Następnie 100 nmol / l siRNA rozcieńczono 250 µl produktu Opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone) i inkubowano przez 5 minut. Następnie 10 µl Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone) rozcieńczono 250 µl Opti-MEM i inkubowano przez 5 minut. Powyższe próbki zmieszano, uzyskując końcowy 500 µl roztworu Opti-MEM i inkubowano przez 20 minut. Podłoże to dodano do 2 ml SMCM (ScienCell, Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone) i inkubowano z komórkami przez 6 godzin. po zmianie na normalne podłoże komórki hodowano przez 72 godziny. zakłócenia wykryto za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym i Western blot. Zastosowano następujące sekwencje siRNA: si-mlck: 5′-3′ CCTGCTTTCATTTTGCCCCC, TCACAAGGCTGAAAGTCCCC.

Test żywotności komórek

komórki mięśni gładkich platerowano w trzech egzemplarzach w płytkach 96-studzienkowych przy 4 × 103 komórkach na studzienkę. Po 24 godzinach komórki leczono TNF-α w różnych dawkach, w tym 0, 0.5, 5, 10, 20, i 40 ng/ml przez 2 godziny. zestaw do oznaczania cck-8 przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie dodano 100 µl do każdej studzienki i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. absorbancję mierzono przy 450 nm za pomocą spektrometru.

ekstrakcję RNA i PCR w czasie rzeczywistym

całkowite RNA wyizolowano z komórek przy użyciu odczynnika Trizolowego (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Integralność RNA oznaczano ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, UT, Stany Zjednoczone). Odwrotną reakcję transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta dla zestawu syntezy cDNA ABScript II (ABclonal, Wuhan, Chiny) i zestawu SYBR Premix ExTaq II (Takara, Dalian, Chiny) za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym (7900HT, ABI). No non-specific amplification was observed based on the dissociation curve. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal control. The data were analyzed using the comparison Ct (2-ΔΔCt) method and expressed as a fold change relative to the respective control. The following sequences were used for qPCR primers: ACTA2: 5′-3′ TTGAGAAGAGTTACGAGTTG, AGGACATTGTTAGCATAGAG; MYL9: 5′-3′ CGGGCCACATCCAATGTCTT, CCATGTTTGAGGATGCGGGT; MLCK: 5′-3′ GGGGACTTTCAGCCTTGTGA, CTGCTTCGCAAAACTTCCTTCT; and CNN1 5′-3′ GGCCCAGAAGTATGACCACC, CCGTCCATGAAGTTGTTGCC.

Analiza Western Blotting

równe ilości białka na pasie (30 µg) poddano elektroforezie na 12% żelu SDS-PAGE. Białka były elektrotransferowane na membranę polifluorku winylidenu (PVDF, Millipore, Billerica, MA, Stany Zjednoczone). Błonę blokowano suchym mlekiem beztłuszczowym 5% / 0,1% Tween-20 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie błonę inkubowano z różnymi pierwotnymi przeciwciałami, w tym z króliczym przeciwciałem przeciw MLCK (rozcieńczenie 1:5000, Abcam), króliczym przeciwciałem przeciw SMA (rozcieńczenie 1:200, Abcam) i króliczym przeciwciałem przeciw kaspazie-3 (1:1000 rozcieńczeń, Technologia sygnalizacji komórkowej). Następnie membranę leczono przeciwciałem wtórnym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Immunoblots badali używać enhanced ECl substrat (Thermo, Rockford, IL, Stany Zjednoczone). Poziom chemiluminescencji zarejestrowano za pomocą systemu obrazowania (Bio-Rad, Hercules, CA, Stany Zjednoczone). Wyniki zostały znormalizowane do β-aktyny.

test i badanie skurczu Fluo-4 AM wapnia

komórki mięśni gładkich były wstępnie obciążone wrażliwym na wapń Fluo-4 AM Fluo-4 AM w roztworze zewnątrzkomórkowym przez 40 minut w temperaturze pokojowej, jak opisano w poprzednim badaniu (Granata i wsp., 2017). Następnie komórki przemywano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wewnątrzkomórkowy strumień wapnia monitorowano jako szereg czasowy, a szybkość akwizycji wynosiła 1 klatkę co 0,1 ms w ciągu 1 minuty przy użyciu mikroskopu konfokalnego Leica przed i po dodaniu pilokarpiny. W celu wykrycia wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia, SMC inkubowano z kalceiną. Do stymulacji użyto kalceiny o stężeniu 20 mM. Strumień wapnia wykryto w HBVSMCs (Zhongqiao Xinzhou Company, Szanghaj, Chiny), si-mlckSMCs i IASMCs przed i po stymulacji TNF-α. Pięć komórek wybrano losowo z pola widzenia, a ślad fluorescencyjny przeanalizowano za pomocą oprogramowania ImageJ pro plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, Stany Zjednoczone).

Analiza statystyczna

wszystkie dane zostały wyrażone jako średnia ± SE. ANOVA z Student–Newman–Keuls wielokrotnych porównań posttest użyto do ekspresji genów. Porównania między dwiema grupami dokonano za pomocą testu t-Studenta. A p< 0,05 uznano za istotnie różniące się. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą Prism GraphPad 6. Każda grupa doświadczalna in vitro została powtórzona trzy razy, a eksperymenty przeprowadzono oddzielnie trzy razy. Wyniki te pochodzą z danych uśrednionych statystycznie.

wyniki

pobranie próbek i analiza Proteomiczna bez etykiety

tętniak wewnątrzczaszkowy (n = 5) i STA (N = 5) porównano grupy Bez istotnych różnic w płci, wieku lub czynnikach ryzyka. Więcej informacji przedstawiono w dodatkowej Tabeli 1. Miejsce pobrania próbki pokazano przez barwienie He i Massona (rysunek 1a). Ściana tętniaka wykazała mniej mięśni i kolagenu w porównaniu ze ścianą STA. Spośród wszystkich 1908 białek zidentyfikowanych z 15426 peptydów zidentyfikowano 180 znacząco różniących się białek między IA i STA, wśród których 88 było regulowanych w górę, a 92 w dół w IA (Fig.1B). Analiza ontologiczna GO sklasyfikowała białka do podkategorii” funkcja molekularna”,” Składnik komórkowy “i” proces biologiczny”. Dalsze dane ekspresji białka uzyskano ze szlaku Mapera KEGG w celu zilustrowania zmian w procesach biologicznych (Fig.1C). MLCK koduje regulacyjny łańcuch lekki miozyny II, znany jako kinaza łańcuchowa miozyny, który został obniżony w IAs. W naczyniowym szlaku skurczu mięśni gładkich, MLCK brał udział w mechanizmie skurczu mięśni gładkich (ryc. 1D).

MLCK jest Downregulowany zarówno w próbkach tkanek, jak i pierwotnych IASMCs

próbki tkanek z STA i IA były podwójnie barwione dla SMA i MLCK. MLCK wykazywał wyższą ekspresję w grupie IA, a SMA słabszą ekspresję w grupie STA w porównaniu z grupą IA. Miozyna-11 jest markerem dojrzałych SMCs, a jednoczesne barwienie z SMA wykazało zmniejszenie kurczliwych SMCs. Powiększenie wykazało również niską ekspresję SMA, co wskazywało na utratę SMCs w tkankach IA. Gęstość SMC wykazała znaczny spadek w próbce IA, co wskazuje na degenerację w ścianie tętniaka (Fig. 1e). Próbki IA wykazały bardziej znaczący spadek MLCK niż STA, zgodny z ustaleniami w proteomice. Obniżono również SMA, co sugerowało, że funkcjonalnie Dojrzałe SMC zostały utracone w ścianie tętniaka (rysunek 1F). Aby sprawdzić, czy obniżenie regulacji MLCK w tkance IA ma podobny wpływ na SMCs, wyizolowaliśmy pierwotne SMCs ze ścian IA (IASMCS). IASMCs były modulowane morfologicznie i pojawiały się jako komórki przypominające pająki z utratą dojrzałych markerów SMC. Te zmiany morfologiczne wykazały, że ciągliwość zmniejszyła się, gdy stres nagle wzrosła. Żywotność komórek była również osłabiona przez cały proces hodowli. IASMCs miał nieregularny kształt i wykazywał słaby dodatni wynik dla SMA, MLCK i miozyny-11 w porównaniu z HBVSMCs. Wyniki immunostaining wykazały, że IASMCs były w stanie niedojrzałym (ryc. 2).

Mlck Downregulation in Primary IASMCs and Its Impact on SMC Function

aby zbadać funkcję SMCs, użyliśmy siRNA do ingerencji w mlck w HBVSMCs, aby naśladować wady genetyczne w IASMCs. Poziom mlck wykazał 50% interferencji, bez znaczącej różnicy w porównaniu z IASMCs (rycina 3A). Wyniki Western blot wykazały, że ekspresja dojrzałych markerów SMC MLCK i SMA była zmniejszona zarówno w IASMCs, jak i si-mlckSMCs w porównaniu z HBVSMCs. Następnie użyliśmy rozszczepionej kaspazy-3 do wykrycia apoptozy. Wyniki wskazywały, że wraz z utratą dojrzałych markerów SMC, SMC prawdopodobnie rozwinęło się do apoptozy (Fig. 3B).

wykryliśmy kurczliwość komórek w tych trzech grupach, aby dokładniej zbadać rolę MLCK podczas skurczu SMC. Pilokarpina jest lekiem cholinergicznym, który może aktywować receptor cholinergiczny. SMC może reagować na bodźce i umowy. Po inkubacji SMC z kalcyną wykryto wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia. Napływ wapnia nie jest taki sam jak “skurcz”, ale cykliczna fala wapniowa w odpowiedzi na agonistę może odzwierciedlać kurczliwość komórek. SMC o niższej ekspresji MLCK wykazywały zmniejszoną kurczliwość w odpowiedzi na stymulację lekiem cholinergicznym pilokarpiną. Lokalna morfologia komórek tych trzech grup była również inna, gdy była symulowana przez pilokarpinę. HBVSMCs wykazywały kształt wrzeciona, a komórki o niskiej ekspresji MLCK wykazywały bardziej Gwiaździsty wzór (Fig. 3C). Wewnątrzkomórkowa odpowiedź wapniowa HBVSMCs różniła się od odpowiedzi zarówno si-mlckSMCs, jak i IASMCs. HBVSMCs generowały cykliczne fale wapnia, podczas gdy si-mlckSMCs, a zwłaszcza IASMCs, nie generowały propagujących się fal wapnia i nagle powróciły do poziomu podstawowego (Rysunek 3D).

genetyczna utrata MLCK wpływa na reakcje zapalne SMCs

aby naśladować środowisko IA, podaliśmy TNF-α w celu zbadania proliferacji i kurczliwości SMCs. Poziomy mRNA czterech dojrzałych genów SMC, mlck, acta2, myl9 i cnn1, wykryto po leczeniu różnymi dawkami TNF-α (Fig.4a). Odkryliśmy, że dojrzała ekspresja markera SMC została zmniejszona przez stymulację wyższymi dawkami TNF-α. Ekspresja dojrzałych markerów SMC, takich jak ACTA2, MYL9, CNN1 i MLCK, była w znacznym stopniu zmniejszona po leczeniu 40 ng/ml TNF-α w porównaniu z tym po leczeniu innymi stężeniami TNF-α w hodowanych SMC. Dlatego stosowaliśmy stężenie 40 ng / ml w leczeniu HBVSMCs, si-mlckSMC i IASMCs. Co ciekawe, HBVSMCs stymulowane TNF-α wykazywały niższą żywotność komórek niż IASMCs i si-mlckSMCs. Tak więc wpływ niedoboru mlck na poziomie genetycznym na żywotność komórek może się różnić od wpływu na stan zapalny (rycina 4B). Ponownie wykryliśmy kurczliwość komórek, aby dokładniej zbadać wpływ na żywotność komórek. Wszystkie komórki wykazywały zmniejszoną kurczliwość w odpowiedzi na stymulację pilokarpiną, ze zmienioną morfologią komórek. Jednakże HBVSMCs miało postać smukłej wrzecionowatości, ale nadal reagowało na pilokarpinę. W przypadku IASMCs morfologia komórek nie była jasna i wykazywała niewielką reakcję na stymulację. Si-mlckSMCs pojawiły się jako krótkie kształty prętów, ale ze słabszą reakcją na stymulację wapnia (rysunek 4C). Wyraźnie zaobserwowano, że wraz ze zmniejszeniem MLCK kurczliwość była zmniejszona we wszystkich trzech grupach, a IASMCs nie mógł generować fal wapnia, a komórki, które genetycznie nie miały MLCK, wydawały się bardziej podatne na ataki zapalne (ryc. 4D).

dyskusja

w tym badaniu zaobserwowano skutki zmniejszenia regulacji MLCK w próbkach IA przy użyciu analizy proteomicznej bez etykiety. SMC z obniżoną regulacją MLCK poddano modulacji fenotypowej i były podatne na apoptozę, gdy były stymulowane TNF-α. Ekspresja MLCK została również zmniejszona w SMC wyizolowanych ze ścian IA (Fig.5). Normalne SMC z downregulated MLCK wykazały zaburzenia funkcji skurczu i były podatne na stan zapalny. W analizie proteomicznej bez etykiety znaleziono białka, które odgrywają rolę w patologii IA, co odzwierciedlało wyniki Znalezione w poprzednich badaniach z użyciem iTRAQ (Wang et al., 2016). Za pomocą mikromacierzy DNA, Chen et al. (2014) okazało się, że myh11, acta2, mlck i my19 były różnicowo wyrażone geny związane ze skurczem VSMC (Chen et al., 2014). Nasze badania skupiły się na SMC i podkreśliły wpływ utraty MLCK na tworzenie IA.

po spadku MLCK nastąpiło zaburzenie skurczu SMCs. SMC przechodzą modulację fenotypową z mniejszą ekspresją genów kurczliwych i wykazują prozapalny, dedifferentiated fenotyp (Owens, 1998; Owens et al., 2004; Yoshida and Owens, 2005). Rozważano modulację fenotypową i ewentualne zwyrodnienie sprzyjające powstawaniu i progresji IA. IASMCs zostały po raz pierwszy wyizolowane przez Bygglin et al. (2011), a obecne badanie było pierwszym wykryciem funkcji IASMCs i kurczliwego genu mlck. IASMCs były modulowane morfologicznie i pojawiały się jako komórki przypominające pająki z utratą dojrzałych cech SMC. Badanie modeli tętniaka królika wykazało duże i gwiaździste komórki z długimi przedłużeniami cytoplazmatycznymi (Dai et al., 2006). IASMCs nie wykazywały już szczelnie ułożonych komórek wrzecionowatych, a morfologię zastąpiono rzadką, nieuporządkowaną formą, w której komórki oddzieliły się od siebie (Merei and Gallyas, 1980). Ta zmiana morfologiczna sugeruje zmniejszenie ciągliwości, gdy znajduje się pod nagłym stresem.

na skurcz i rozluźnienie komórek mięśni gładkich wpływa nie tylko ilość podawanego Ca2+, ale także stres oksydacyjny i stan zapalny bezpośrednio lub pośrednio (Carvalho-de-Souza et al., 2013). Wcześniejsze badania wykazały, że regulatorowe łańcuchy świetlne fosfatazy miozyny związane były z miozyną, której skurcze były podyktowane stymulacją aktywności ATPazy miozyny (Murthy, 2006). Wapń wzrasta i wiąże się z kalmoduliną, a kompleksy wapń / kalmodulina następnie łączą się z MLCK, prowadząc do fosforylacji MLC. Pokazaliśmy również zmiany morfologiczne i wykryliśmy kurczliwość IASMCs i HBVSMCs z obniżonym mlck na fig. 3, 4. Wraz ze wzrostem poziomu Ca2+, wapń może wiązać się z kalmoduliną i prowadzić do fosforylacji MLC. W środowisku tętniaka, wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+, jako drugiego Posłańca, zmniejszyło się. W związku z tym zmniejszono również fosforylację indukowaną przez wapń. Zależny od Ca2 + / kalmoduliny MLCK fosforylowany MLC jest niezbędny do rozpoczęcia skurczów mięśni gładkich. Długotrwałe fosforylowanie MLC może być indukowane przez niezależne od Ca MLCK. Tak więc, przy obniżonej regulacji MLCK, aktywność fosfatazy MLC może być również obniżona. Aktywność fosfatazy MLCK i MLC może koregulować relaksację komórek (Murthy, 2006). Relaksacja SMC może wynikać z aktywacji TGR5 poprzez hamowanie szlaku kinazy rhoa/Rho. Fosforylacja MLC poprzez niezależny od Ca2 + MLCK może podtrzymywać aktywację białka G i regulować hamowanie fosfatazy MLC(Rajagopal i wsp ., 2013).

Gen mlck jest wyraźnie różnie wyrażony w IA w porównaniu z tętnicami kontrolnymi. W naszym eksperymencie ekspresję MLCK można również zmniejszyć przez stymulację zapalną, a SMCs wykazały niższą żywotność przy wyższej dawce TNF-α. Podczas zapalenia śródczaszkowego ekspresja MLCK zmniejszyła się w SMC. Dodatkowo aktywność fosfatazy MLC może być również obniżona (Murthy, 2006). W dużej mierze nie wiadomo, czy MLCK powoduje lub wynika z fenotypowej i funkcjonalnej modulacji SMCs. Nasze wyniki sugerują, że MLCK może promować dysfunkcję SMC; jest to jednak pierwsze badanie wspierające tę hipotezę. Chociaż TNF-α może hamować ekspresję dojrzałych genów SMC, normalne SMC może zachować zdolność skurczu w pewnych stanach zapalnych (Ali i wsp ., 2013). Gdy zapalenie wystąpiło w SMC bez MLCK, skurcze były głęboko tłumione, co wyjaśniało, dlaczego niektóre IA nie utrzymywały stabilności przez cały okres życia jednostki.

patologia tętniaka wewnątrzczaszkowego obejmuje również apoptozę, która prowadzi do osłabienia wewnętrznej i Medialnej ściany tętniaka. Czynniki zapalne, takie jak TNF-α, mogą wywołać sygnał indukcyjny w inicjacji apoptozy (Jamous i in., 2007; Sprague and Khalil, 2009; Ait-Oufella et al., 2011). TNF-α i IL-1 są najważniejszymi czynnikami prozapalnymi, które są często stosowane do indukowania ogniskowej odpowiedzi zapalnej. Liczne badania wykazały, że TNF-α zwiększa się i odgrywa kluczową rolę w występowaniu i rozwoju tętniaków. Dlatego użyliśmy TNF-α do naśladowania środowiska tętniaka (Ali et al., 2013; Aoki et al., 2014; Starke et al., 2014). W środowisku zapalnym hamowano rozluźnienie mięśni gładkich, co było spowodowane przez rozpuszczalną aktywność guanylową (Rajagopal i wsp., 2015). Zaburzenia SMC lub apoptoza były uważane za destrukcyjne zdarzenia w pękniętej IA. Nasze wyniki wykazały, że utrata MLCK w SMCs może prowadzić do progresji apoptotycznej i promować obrażenia w środowisku prozapalnym. Ciągła utrata SMC i funkcjonalna synteza składników kolagenu i matrycy spowodowały powiększenie i pęknięcie tętniaka (Frosen, 2014). Odkryliśmy, że nastąpił znaczny spadek ekspresji MLCK w IA poprzez analizę proteomiczną. Po zakłóceniu wyciszania RNA MLCK stwierdziliśmy, że kurczliwość SMC zmniejszyła się, a apoptoza wzrosła. Dodatkowo obniżono ekspresję SMA. Dlatego spekulowaliśmy, że zmniejszenie MLCK może sprzyjać rozwojowi tętniaka. Wiele innych obniżonych białek w tkankach IA i STA, takich jak filamina-C, desmin i dehydrogenaza aldehydowa, zostało znalezionych poprzez analizę proteomiczną. Wykazaliśmy, że MLCK jest mniej ekspresji w IASMCs i że inne białka nie były zwykle ekspresji w SMCs. Dlatego wybraliśmy MLCK jako cel w obecnym badaniu.

były też pewne ograniczenia, które wymagają dalszej poprawy. IASMCs wyizolowano z tkanek IA i hodowano przy użyciu SMCM. Wyizolowaliśmy SMC ze ściany IA bezpośrednio przez cięcie małych kawałków tkanek IA i wykorzystaliśmy tylko komórki w trzech fragmentach, aby uniknąć skutków warunków hodowli in vitro. Komórki otrzymywano w charakterze apoptotycznym i nie można było ich przekazywać przez kilka pokoleń, ograniczając tym samym eksperymenty in vitro. Czy Gen mlck odgrywa kluczową rolę w dysfunkcji IASMC i czy istnieją mutacje mlck nadal wymaga dalszych badań.

podsumowując, niniejsze badanie dostarczyło nowych dowodów pokazujących, że obniżenie regulacji MLCK w SMCs wpłynęło na organizację dojrzałych i funkcjonalnych tętnic. Niższa ekspresja MLCK dodatkowo doprowadziła do zwiększenia apoptozy podczas odpowiedzi zapalnej, co spowodowało utratę SMCs i dysfunkcję skurczu. To badanie jest pierwszym, który wykorzystuje podstawowe IASMCs do wykrywania funkcji SMC. Nasze wyniki zapewniają dalsze wsparcie, że MLCK jest zaangażowany w skurcz SMC, proliferację i apoptozę. Nasze wyniki wykazały również, że homeostaza SMCs ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania tętnic wewnątrzczaszkowych.

wkład autora

YaS i PL zaprojektowały i przeprowadziły eksperymenty, przeanalizowały dane oraz sporządziły manuskrypt i rysunki. G-YY i WZ opracowały projekt, zaprojektowały eksperymenty i zredagowały ostateczny rękopis. ZL i YuS brały udział w projektowaniu badania. JH, SL i YL przyczyniły się do zbierania próbek. ZZ i YW pomogły zaprojektować eksperymenty i zinterpretować dane.

finansowanie

to badanie było wspierane przez Shanghai Sailing Program, Projekt nr 16yf1401200 (PL), NSF Chin, nr 81571102 (WZ), Narodowy kluczowy program badawczo-rozwojowy Chin (2016YFC1300600), National Natural Science Foundation Of China (81771251, G-YY; 81771244, ZZ; 81471178, g-YY; i 81522015, yw), Fundacja Edukacyjna KC Wong (G-YY) oraz Komisja nauki i technologii gminy Szanghaj (17zr1413600, ZZ).

Oświadczenie o konflikcie interesów

autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

podziękowania

autorzy chcieliby podziękować Yanye Feng za analizę proteomiczną oraz pracownikom Centrum neuronauki i Neuroinżynierii za wspólne wsparcie.

Materiały uzupełniające

Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć w Internecie pod adresem: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2018.00416/full#supplementary-material

Abbreviations

HBVSMC, human brain vascular smooth muscle cell; IA, intracranial aneurysm; IASMCs, intracranial aneurysm smooth muscle cells; MLCK, myosin light chain kinase; SMA, anti-SM-α actin; SMCs, smooth muscle cells; STA, superficial temporal artery.