Ellmans analys för kvantifiering av fria Sulfhydryler i antikroppar
ellmans reagens, 5,5′-dithio-bis-(2-nitrobensoesyra), även känd som DTNB, är en vattenlöslig förening reagerar med fria sulfhydrylgrupper i lösningar vid svagt alkaliskt tillstånd för att ge en blandad disulfid och mycket kromogen 5-Nitro-2-Tiobensoesyra (TNB) med molär utrotningskoefficient (molar absorptionsförmåga) på 14.15 mM-1cm-1 vid 412 nm.
detta är ett standardprotokoll framställt av Encapsula Nanovetenskap för bestämning av fria tioler i små peptider och proteiner, som vanligtvis är reducerade från och stabila till oxidation i sura lösningar.
ellmans analys är nödvändig före konjugering av Fab ‘ – fragment och tiolerade antikroppar mot liposomer innehållande maleimid.
kvantifiering av Sulfhydryler med Cysteinstandarder
- Förbered 0,1 m natriumfosfatbuffertlösning, pH 8,0 (Reaktionsbuffert).
- Lös upp 4 mg / mL ellmans reagens, 5,5′-dithio-bis-(2-nitrobensoesyra) (DTNB) i Reaktionsbufferten (Ellmans Reagenslösning).
- Lös upp 5,268 mg cysteinhydrokloridmonohydrat (MW = 175,6) i Reaktionsbuffert vid en initial koncentration 1,5 mM (Standard A i tabellen nedan) . Förbered en uppsättning cysteinstandarder genom seriellt utspädning av Standard A baserat på tabellen nedan.
- tillsätt 50 occl av ellmans reagens till varje standard och blanda väl.
- inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Mät den optiska absorbansen vid 412 nm.
- plotta absorbansvärdena erhållna för varje standard kontra cysteinkoncentrationer (kalibreringskurva) och bestäm koncentrationen av fri sulfhydryl i provet från kurvan.
| slutlig koncentration (mM) | cystein | Reaktionsbuffert (mL) |
Standard |
|---|---|---|---|
| 1,50 | 5,268 mg | 20 | a |
| 1.25 | 5 mL of Standard A | 1 | B |
| 1.00 | 4 mL of Standard A | 2 | C |
| 0.75 | 3 mL of Standard A | 3 | D |
| 0.50 | 2 mL of Standard A | 4 | E |
| 0.25 | 1 mL of Standard A | 5 | F |
| 0.00 | 0 | 5 | Blank |
Quantification of Sulfhydryls Using Extinction Coefficient Calculation
- Prepare 0.1 M sodium phosphate buffer solution, pH 8.0 (Reaction Buffer).
- Dissolve 4 mg Ellman’s Reagent in 1 mL of Reaction Buffer (Ellman’s Reagent Solution).
- For each sample, prepare two test tubes containing 25 µL of Ellman’s Reagent Solution and 1.250 mL of Reaction Buffer.
- Lägg till 0,125 occl okänt prov i ett provrör som framställts i steg 3.
- Förbered ett ämne genom att lägga till 125 occyl Reaktionsbuffert i det andra provröret som framställts i steg 3.
- blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- noll spektrofotometern på ämnet vid 412 nm och mät provets optiska absorbans.
Obs: Höga koncentrationer (>1 mM) av fri sulfhydryl kan minska noggrannheten hos den uppmätta koncentrationen av sulfhydryl på grund av dess högre absorbansvärden. I detta fall rekommenderas att späda provlösningen så att 0,1786 mL alikvot innehåller mindre än 1 mM fri sulfhydryl.
hur man beräknar den fria Sulfhydrylkoncentrationen
Här är ett enkelt, steg för steg exempel på hur man beräknar koncentrationen av fri sulfhydryl i ett prov:
en 125 occl alikvot av okänt prov blandas med 1.250 mL Reaktionsbuffert och 25 occl av Ellmans Reagenslösning gav en absorbans av 0,750 (efter subtraktion av ämnet) med användning av en 1 cm spektrofotometrisk kyvett. Beräkna sulfhydrylkoncentrationen i augylmoler per mL okänt prov. Den molära utrotningskoefficienten för TNB i detta buffertsystem vid 412 nm är 14150 M-1cm-1. Molar absorptivity, XXL, definieras enligt följande:
där A är absorbans är d banlängden (cm) och är koncentrationen av lösningen i den spektrofotometriska kyvetten (M). Därför:
M (mol/L)
för att beräkna koncentrationen av sulfhydryl i provet behövs den totala volymen av analysen och totala mol fri sulfhydryl.
mL
därför antalet mol sulfhydryl i alikvot:
mol
eftersom analyslösningen innehåller endast 0,1786 mL av originalet prov. Koncentrationen av fri sulfhydryl i det ursprungliga provet erhålls enligt följande:
M
Leave a Reply